免疫治疗是目前无驱动基因突变转移性非小细胞肺癌(mNSCLC)患者的标准一线治疗。然而，PD-L1 肿瘤比例评分（TPS）是不完善的生物标志物，因此，需要探索新的生物标志物以更好地筛选免疫治疗可能获益人群。肿瘤突变负荷（TMB）作为一种新兴的生物标志物，回顾性研究显示基于组织的TMB（tTMB）与免疫治疗mNSCLC的临床疗效直接相关。 近期，基于ctDNA的下一代测序（NGS）技术已用于测定血浆中的TMB（pTMB）。本研究评估了基于血浆的2.145-Mb 500基因NGS panel，以测量基线pTMB和特定的阴性预测因子突变，66例mNSCLC患者接受了一线帕博利珠单抗的标准治疗。研究方法
研究设计：2017年3月1日至2018年10月11日，纳入经过病理证实为mNSCLC并接受以帕博利珠单抗为基础的一线治疗患者（Clinicaltrial.gov识别码：NCT03047616）。这项研究得到了宾夕法尼亚大学（宾夕法尼亚州费城）机构审查委员会的批准。
基于血浆的突变检测：在开始使用基于帕博利珠单抗的治疗前，获得基线血浆，使用2.145 Mb GuardantOMNI panel进行测序。原始突变计数针对样品特异性肿瘤脱落和分子覆盖率进行了校正，校正后的计数报告为 pTMB（单位mut/Mb）。采用11份经鉴定的回顾性多类型肿瘤血浆标本(包括NSCLC)评估了其重复性。在硅片分析中，对513例来自癌症基因组图谱的组织样本进行了pTMB与全外显子组测序(WES)测定的TMB一致性评估。
统计学分析：基于本研究的预实验验证与现有文献，选择了16 mut/Mb的临界值用于其他分析。使用对数秩检验对高pTMB（≥16 mut/Mb）和低 pTMB（<16 mut/Mb）的患者生成了PFS和OS的Kaplan-Meier曲线，并进行了比较。为了确定阴性预测因子与免疫治疗反应的关联，使用Cox PH模型测试了ERBB2，STK11，KEAP1，PTEN，KRAS 和 PIK3CA中的突变与PFS和OS的关联。
表1. 患者基线特征
结果
基线pTMB与基于帕博利珠单抗的治疗反应相关
研究共纳入66例患者，其中31（47%）例接受帕博利珠单抗治疗，中位治疗时间4.1个月，35（53%）例接受帕博利珠单抗联合铂类加培美曲塞治疗，中位治疗时间7.1个月，两组的中位OS分别为22.1个月和21.9个月。66例患者中52例（78.8%）的pTMB可评价，由于肿瘤脱落率低或单一分子覆盖率低，14例患者无法评估pTMB。平均pTMB为16.8mut/Mb，没有发现样本为微卫星高度不稳定型（MSI-H）。与之前的报告一致，pTMB与组织PD-L1表达没有相关性。
所有入选的患者中，45例患者在第9周可用RESIST评估疗效，在第9周达到完全缓解/部分缓解（CR/PR）（应答者）的患者中位pTMB为21.5 mut/Mb，而疾病稳定/疾病进展（SD/PD）患者（无应答者）的pTMB中位数为13.9（P=0.037）。在21例接受帕博利珠单抗治疗的9周可评估患者中，有应答者的平均pTMB为19.3，无应答者的平均pTMB为15.2；这一差异未达到统计学意义（P=0.336）。24例接受铂类加培美曲塞化疗的患者中有应答者中位pTMB为23.9，而无应答者为12.8 mut/Mb（P=0.034）。
图1. pTMB和对帕博利珠单抗的反应
在第6个月52例可接受评估的患者中，达到持续临床获益（DCB；持续6个月以上的CR/PR/SD）的患者pTMB中位数高于未达到持续临床获益者（NDB；持续6个月以上的PD/SD），分别为21.3和12.4 mut/Mb（P=0.003）。26例接受帕博利珠单抗治疗的患者中位pTMB差异也非常显著，达到DCB的患者中位pTMB为21.1 mut/Mb，NDB的患者中位pTMB为13.4 mut/Mb（P=0.032）。在接受铂类加培美曲塞化疗的26例患者中，DCB患者的pTMB中位数为22.0 mut/Mb，而NDB患者的pTMB中位数为11.9 mut/Mb（P=0.057；图1B）。
利用16 mut/Mb作为临界值，pTMB≥16和<16 mut/Mb的中位PFS分别为14.1个月和4.7个月（HR，0.30；95%CI，0.16–0.60；P<0.001）。52例pTMB可评估患者中有28例（53.8%）pTMB≥16mut/Mb。在多变量Cox模型分析中，当比较pTMB≥16与<16mut/Mb时，包含协变量并没有显著改变估算的HR。接受帕博利珠单抗治疗的26例患者的中位PFS为14.1对2个月，接受铂类加培美曲塞化疗的26例患者中位PFS为13.8对5个月，PFS与pTMB的表达相关；在接受帕博利珠单抗治疗的患者中，中位OS没有显著差异，pTMB高和pTMB低表达的中位OS分别为NR对8.8个月；HR，0.48（0.22-1.03）；P=0.061，接受帕博利珠单抗单药治疗的患者中位OS为NR对6.1个月[HR，0.49（0.17-1.42）；P=0.187]，接受铂类联合培美曲塞化疗中位OS为NR对19.2个月 [HR，0.50（0.16–1.54）；P=0.228；图1C]。
ctDNA检测突变与帕博利珠单抗治疗反应的相关性探讨
在研究中，6例pTMB高的患者没有达到DCB（图1B）。我们假设突变图谱可能提高pTMB与反应的相关性。既往研究发现STK11、KEAP1和PTEN的功能缺失突变，以及激活的ERBB2外显子20插入与免疫检查点抑制剂治疗无响应相关；而KRAS和PIK3CA突变与提高免疫检查点抑制剂的响应相关。染色体非整倍体（FGA）的增加与不良结局相关，因此对它进行评估（图2A）；FGA与反应无显著相关性（P=0.198）。pTMB≥16且无阴性预测突变患者的中位PFS为18.0个月，而pTMB<16或任何阴性预测突变患者的中位PFS为4.7个月。pTMB≥16且无阴性预测突变的患者中位OS未达到，而pTMB<16mut/Mb或任何阴性预测突变的患者中位OS为8.4个月。
图2. 突变分析和对帕博利珠单抗的反应
讨论
这项前瞻性研究是目前探索pTMB与一线标准方案（帕博利珠单抗联合治疗）治疗mNSCLC患者预后相关性的最大研究。总有效率、中位PFS和中位OS与大型III期试验中观察到的相似。使用2.145 Mb NGS panel分析pTMB，发现在治疗9周(P=0.037)和6个月(P=0.003)有反应的患者中位pTMB显著较高。采用16 mut/Mb的pTMB作为临界值，证明pTMB≥16 mut/Mb的患者PFS改善(HR=0.30)，且更有可能维持DCB (OR=8.9)。同时发现，结合STK11/KEAP1/PTEN突变和ERBB2外显子20插入突变可以提高预测疗效的能力。与既往报道相似，pTMB与肿瘤PD-L1表达无相关性。总之，该研究结果表明，在NSCLC中，pTMB与基于帕博利珠单抗的一线治疗疗效相关。
